骑士团直到1530年才拥有自己的领土，当时大团长菲利普·德·维利耶（Fra' Philippe de Villiers de l'Isle Adam）占领了马耳他岛（Malta）。
该岛是由神圣罗马皇帝查理五世和他的母亲卡斯蒂利亚女王琼娜（Queen Joanna of Castile）以西西里国王的身份授予骑士团的，得到了教皇克莱门特七世（Pope Clement VII）的批准，骑士团因此需遵守《马耳他猎鹰的贡品》（Tribute of the Maltese Falcon）的条件。
在1565年，骑士们在大团长让·德·瓦莱特（Fra' Jean de Valette，曾在土耳其船上和德拉古特一起划桨）的领导下，成功防御了奥斯曼帝国的围攻，持续了三个多月。
骑士团的舰队在1571年的莱班托海战（Battle of Lepanto）中对奥斯曼海军力量的最终摧毁做出了贡献，该战役由西班牙国王菲利普二世（King Philip II of Spain）的异母兄弟奥地利的约翰�
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